小鼠Flag標(biāo)簽(Flag-tag)檢測試劑盒
簡介
FLAG標(biāo)簽，或FLAG八肽，或FLAG表位，是一種多肽蛋白質(zhì)標(biāo)簽，可以用重組DNA技術(shù)添加到蛋白質(zhì)中，其序列圖案為DYKDDDDK（其中D=天冬氨酸，K=賴氨酸），它是最特異的標(biāo)簽之一，是一種通用種屬工抗原，已經(jīng)開發(fā)出特異的、高親和力的單克隆抗體，因此可用于親和層析法的蛋白質(zhì)純化，也可用于定位活細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，它已被用于分離重組的、過量表達的蛋白和宿主生物體表達的野生型蛋白，它還可用于分離具有多個亞單位的蛋白質(zhì)復(fù)合物，因為其溫和的純化過程往往不會破壞這種復(fù)合物，它已被用于獲得足夠純度和質(zhì)量的蛋白質(zhì)，以通過X射線晶體學(xué)進行三維結(jié)構(gòu)測定，F(xiàn)LAG標(biāo)簽可用于許多需要抗體識別的不同檢測中，如果沒有針對某一特定蛋白的抗體，在蛋白上添加FLAG標(biāo)記，就可以用針對FLAG序列的抗體來研究該蛋白，例如通過免疫熒光、免疫沉淀或通過SDS PAGE蛋白電泳和Western印跡檢測進行細胞定位研究，從N端到C端的FLAG標(biāo)簽的肽序列是，DYKDDDDK（1012Da），此外，它還可以串聯(lián)使用，常見的是3xFLAG肽，DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK（標(biāo)簽編碼一個腸激酶裂解位點），它可以與蛋白質(zhì)的C端或N端融合，或插入到蛋白質(zhì)內(nèi)，一些市售的抗體（如 M1/4E11）只有在N端出現(xiàn)時才能識別該表位，然而，其他可用的抗體（如M2）則對位置不敏感，F(xiàn)LAG標(biāo)簽中的殘基可以被硫酸化，這可能會影響抗體對FLAG表位的識別，F(xiàn)LAG標(biāo)簽可以與其他親和力標(biāo)簽一起使用，例如多標(biāo)簽（His標(biāo)簽）、HA標(biāo)簽或myc標(biāo)簽。

檢測原理

本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準品中的待測物Flag-tag，清洗后，再加入抗體標(biāo)記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體"免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標(biāo)準曲線計算出樣本中Flag-tag的濃度。

操作要點

1. 混合蛋白質(zhì)溶液時，應(yīng)始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個標(biāo)準品、樣品和試劑時應(yīng)更換移液器槍頭。此外，每種試劑應(yīng)單獨使用容器。

2. 確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準確的結(jié)果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。

3. 當(dāng)使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。

4. 顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應(yīng)從無色變?yōu)樗{色。

5. 應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；

6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀釋標(biāo)準品和樣品的試管。

注意事項

1. 本試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹慎操作。

2. 本試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

4. 佩戴防護手套、眼睛和面部防護用品，處理后洗手。

試劑準備

1. 使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

2. 洗滌液/稀釋液配置：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1: 20稀釋（例如：1mL濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）

標(biāo)準品配置

試劑盒中取出標(biāo)準品，準備7個試管，先從160ng/mL標(biāo)準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至8ng/mL（例：50μL的標(biāo)準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的8ng/mL濃度標(biāo)準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將8ng/mL標(biāo)準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標(biāo)準品，依次為:  8ng/mL、 4ng/mL、 2ng/mL、 1ng/mL、 0.5ng/mL、 0.25ng/mL、 0.125ng/mL，從高濃度標(biāo)準品溶液中吸取500μL標(biāo)準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標(biāo)準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準品(0ng/mL)。

結(jié)果的計算

計算標(biāo)準品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準曲線（作圖時去掉空白組的值）或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標(biāo)準曲線。若樣品OD值高于標(biāo)準曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

小鼠Flag標(biāo)簽(Flag-tag)檢測試劑盒
示例數(shù)據(jù)

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標(biāo)準曲線。

本圖所示標(biāo)準曲線僅供示例，結(jié)果計算應(yīng)以同次試驗標(biāo)準品所繪標(biāo)準曲線為準計算樣本結(jié)果
靈敏度

經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.06ng/mL。

特異性

該試劑盒測定可識別重組小鼠Flag-tag。

其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。

實驗步驟匯總
1. 加標(biāo)準品及樣品，37℃避光反應(yīng)1.5h，洗滌3次。

2. 加檢測抗體，37℃避光反應(yīng)1h，洗滌4次。

3. 加酶結(jié)合物，37℃避光反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。

4. 加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。

5. 加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。

小鼠Flag標(biāo)簽ELISA檢測試劑盒用于定量檢測細胞培養(yǎng)上清、血清、血漿中小鼠的Flag-tag使用本產(chǎn)品之前，必須完整閱讀本說明書，小鼠ELISA試劑盒僅供科研使用，不能于其它診斷。